...请高手能帮忙介绍下水稻设计引物的步骤,过程能够简绍下方法。非常感...
发布网友
发布时间：2024-05-15 14:07
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热心网友
时间：2024-06-04 05:40
① 引物长度
一般引物长度为18~30碱基。总的说来，决定引物退火温度（Tm值）最重要的因素就是引物的长度。有以下公式可以用于粗略计算引物的退火温度。
在引物长度小于20bp时：[4(G+C)+2(A+T)]-5℃
在引物长度大于20bp时：62.3℃+0.41℃(%G-C)-500/length-5℃
另外有许多软件也可以对退火温度进行计算，其计算原理会各有不同，因此有时计算出的数值可能会有少量差距。为了优化PCR反应，使用确保退火温度不低于54℃的最短的引物可获得最好的效率和特异性。
② GC含量
一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%，一对引物的GC含量和Tm值应该协调。若是引物存在严重的GC倾向或AT倾向则可以在引物5’端加适量的A、T或G、C尾巴。
③ 退火温度
退火温度需要比解链温度低5℃，如果引物碱基数较少，可以适当提高退火温度，这样可以使PCR的特异性增加；如果碱基数较多，那么可以适当减低退火温度，是DNA双链结合。一对引物的退火温度相差4℃～6℃不会影响PCR的产率，但是理想情况下一对引物的退火温度是一样的，可以在55℃～75℃间变化。
④ 避免扩增模板的二级结构区域及错配
像二级结构、错配等在Primer Premier 5均有判断，最后再加一步同源性分析，避免引物的非特异性扩增。
热心网友
时间：2024-06-04 05:34
第二种方案：首先要找出你要设计引物的基因的mRNA序列，然后用引物设计软件设计引物，再用e-pcr进行能否检测，看是否这对引物能扩增出片段
第三种方案：最简单，别人直接找已经设计好的，例如在NCBI上的uniSTS上就有这功能
