琼脂糖凝胶的配制及SDS-PAGE电泳流程

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SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是检测蛋白质分子量的有力工具，其原理基于蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率与分子量的线性关系。十二烷基硫酸钠（SDS）在此过程中发挥关键作用，它能够与变性蛋白质结合，使其带负电荷，从而使得蛋白质迁移率仅与其大小相关，而不受序列影响。标准蛋白质的迁移率对分子量作图可形成一条标准曲线，未知蛋白质的迁移率在相同条件下电泳后，便能在该曲线上求得分子量。

进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳所需试剂和设备包括蛋白样品、SDS-PAGE加载缓冲液、PBS、Tris-Hcl（pH 8.8和6.8）、30%丙烯酰胺、10%SDS、10%过硫酸铵、5×SDS-PAGE电泳缓冲液、考马斯亮蓝R-250染色液、脱色液、天能预制胶以及垂直电泳槽、电泳仪、电源、移液枪、离心管和试剂瓶等。

实验步骤分为凝胶配置和电泳两大部分。首先配置分离胶，确保配胶器干燥并试漏。将水、30%丙烯酰胺、1.5M Tris-Hcl（pH 8.8）、10%SDS、10%过硫酸铵加入小烧杯中混匀，加入TEMED使胶凝固。将分离胶灌入胶板，用水压平后等待凝固。若使用预制胶，直接拆开即可使用。接着配置浓缩胶，待分离胶凝固后进行灌胶并插入梳子，倒置胶板，凝固后放入电泳槽，并加入缓冲液浸泡。

SDS-PAGE电泳过程包括调胶、点样和电泳。拔掉梳子后调整齿位置，用小枪头吸取样品点入胶孔。浓缩胶以低电压（100V）电泳，分离胶以高电压（150V）电泳，直至胶内的蓝色完全跑出，一般耗时1-2小时。电泳后卸胶，进行染色和脱色，染色液中过夜染色后，脱色液中脱色直至背景发白，完成蛋白质分子量的测定。