免疫斑点试验基本步骤

发布网友 发布时间：2024-10-23 21:33

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热心网友 时间：2024-10-27 04:32

免疫斑点试验基本步骤

方法一：辣根过氧化物酶免疫斑点试验

1. 将0.01M PBS PH7.4 稀释的抗原液点于硝酸纤维素膜上，大小为2μl。

2. 置于37℃温箱中干燥20～30分钟。

3. 滴加封闭液，37℃温盒中封闭10分钟。

4. 用洗涤液洗1～2次，滤纸吸干。

5. 加用稀释液稀释的抗体或待检标本，置于37℃湿盒中30分钟。

6. 用洗涤液震洗3次×3分钟、吸干。

7. 加1∶50稀释的抗鼠IgG血清，置于室温湿盒中10分钟，震洗1次、吸干。

8. 加辣根过氧化物酶标记的抗抗体，室温湿盒中30分钟，洗涤吸干。

9. 加显色底物反应5-10min。

10. 水洗终止反应，观察结果。出现明显综色斑点者为阳性。

方法二：碱性磷酸酶免疫斑点试验

1. 将0.01M PBS PH7.4 稀释的抗原液点于硝酸纤维素膜上，大小为2μl。

2. 置于37℃温箱中干燥20～30分钟。

3. 用封闭液37℃湿盒中封闭10分钟。

4. 用洗涤液震洗1～2次，滤纸吸干。

5. 加稀释液稀释的小鼠抗体或待检标本，置于室温湿盒中30分钟。

6. 用洗涤液震洗3次×3分钟，吸干。

7. 加1∶50稀释的兔抗鼠IgG或羊抗鼠IgG血清，置于室温湿盒中30分钟，洗同前、吸干。

8. 加APAAP复合物于膜上、室温湿盒中30分钟，洗同前、吸干。

9. 加APAAP复合物，温育、洗涤同“9”。

10. 重复“9”和“10”1～3次。

11. 洗涤液震洗3次×3分钟、吸干。

12. 滴加新配底物溶液显色5～10分钟，水洗中止反应，观察结果。

免疫斑点试验(Dot Immunobinding Assay, DIBA)是利用硝酸纤维素膜(N、C或醋酸纤维素膜作为固相支持物，进行抗原抗体反应的免疫学检测方法。该法具有微量、快速、经济、方便等特点，可用于检测抗体或抗原。近年来已较多地应用于医学基础研究和疾病的诊断。