Western blotting实验攻略
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发布时间：14小时前
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时间：13小时前
一、蛋白样品制备
1. 细胞蛋白样品的制备：
细胞培养至80%密度时，用胰蛋白酶消化或细胞刮处理，细胞经冷PBS漂洗，离心后加入博士德培养细胞总蛋白提取试剂，反复吹打混匀。如有粘稠物，超声处理至溶液无粘稠，置冰上裂解。再次超声处理后离心，取中层蛋白溶液，加入蛋白上样缓冲液，置水浴箱变性。
2. 组织蛋白样品的制备：
手术后的组织迅速置于预冷生理盐水中，洗去血迹，组织称量后切成小块，按比例加入哺乳动物组织总蛋白提取试剂（需提前加入博士德酶抑制剂），匀浆。超声处理后置冰上裂解，离心取上层蛋白溶液，加入缓冲液，置水浴箱变性。
3. 蛋白定量：
收集蛋白样品，测定浓度，常用试剂盒如BCA蛋白定量试剂盒，微量BCA蛋白定量试剂盒，考马斯亮蓝增强型蛋白定量试剂盒。考马斯亮蓝测定简便迅速，但标准曲线线性差，受干扰物质影响较大。BCA法操作简单，试剂稳定性好，灵敏度高，不受去垢剂影响。
二、凝胶制备
根据目的蛋白分子量配制分离胶，轻摇混匀，缓慢注入灌胶装置，液面上加水，静置37℃凝固。按比例配制浓缩胶，滤纸吸去水，注入浓缩胶溶液，插入梳子，静置凝固，准备上样。
三、上样
加入电泳缓冲液，上样（处理好的样品，阳性对照蛋白样本和重组蛋白，彩色预染Marker），保证每孔总蛋白量30-50μg，总上样量小于30ul，上样时间尽量短。
四、电泳
上样后，选择适当的电压，浓缩胶电泳电压70-80V，分离胶电泳电压90-110V，直至溴酚蓝染料前沿下至凝胶末端停止，电泳时间约2-3小时。
五、染胶
使用凝胶蛋白质蓝染试剂，凝胶蛋白质快速蓝染试剂，蛋白质银染检测试剂检测电泳。染胶仅用于检测样品电泳是否成功，不可用于后续操作。
六、转膜
湿式电转膜，按“三明治”模型操作，电转印夹，海绵垫，滤纸，凝胶，NC膜，确保膜无气泡，转印槽加满缓冲液，放入电转印夹，放入冰箱，确保NC膜靠近正极，带负电的氨基酸和蛋白质向正极迁移，选择恒流，每个转印槽建议电流150-300mA，时间调整。
七、封闭
漂洗印迹膜，博士德Western洗涤缓冲液室温漂洗3次，取出后放入封闭缓冲液，摇床摇动，4℃封闭1.5-2小时。
八、抗体孵育
加入一抗，4℃过夜，洗涤缓冲液洗膜3次，加入二抗，4℃孵育2小时，洗膜3-6次。
九、蛋白检测
根据标记二抗的检测方法，常用化学发光检测（ECL）和化学显色DAB检测。ECL显色试剂配制，显色底物覆盖印迹膜，暗室曝光记录结果。DAB显色液配制，室温显色，出现棕黄色蛋白条带。
