糖二磷酸钠含量测定固体复合酶试剂法 公式计算出的:果糖二磷酸钠(%...
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发布时间：2024-06-19 06:51
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时间：2024-06-19 07:15
（1）试剂 空白酶溶液：取固体复合酶（酶活力测定方法见注1，活力应符合规定）60mg，用盐酸三乙醇胺缓冲液（取三乙醇胺17.5g，加水约200ml，加盐酸4ml，混匀，加乙二胺四乙酸二钠3.7g，溶解后，用2mol/L氢氧化钠溶液或2mol/L盐酸溶液调节pH值至7.6，加水稀释至250ml。滤过后4℃保存，一周内使用。）溶解并稀释至20ml。垂熔漏斗过滤，4℃保存，两天内使用。
测定酶溶液：取空白酶溶液10ml，加还原型辅酶Ⅰ（NADH）3.0mg，溶解后4℃保存，两天内使用。
（2）供试品溶液的制备 取本品适量，精密称定，加水溶解并制成每1ml约含0.4mg（按无水物计)的溶液。
（3）测定法 精密量取盐酸三乙醇胺缓冲液2ml，测定酶溶液1ml，置石英吸收池中；另精密量取上述缓冲液2ml，空白酶溶液1ml置另一吸收池，作为空白，摇匀，静置15分钟，照紫外-可见分光光度法（中国药典2010年版二部附录ⅣA），在340nm波长处测定吸光度A1。各池再分别精密加入供试品溶液0.1ml，摇匀，于20℃～25℃放置10分钟，在340nm的波长处测定，直至吸光度基本不变，读取吸光度A2。求出吸光度差值ΔA（ΔA= A1－1.0333A2），按下式计算，即得。
式中 3.0为加入供试品溶液前样品池中溶液的体积（ml）；
6.29 103为还原型辅酶Ⅰ(NADH)的摩尔吸收系数；
2为果糖二磷酸钠反应系数；
406.06为C6H11Na3O12P2的分子量；
0.1为供试品溶液加入体积(ml)；
W为供试品的取样量(mg) （以无水物计）。
混悬液酶试剂法
(1)试剂 盐酸三乙醇胺缓冲液（0.4mol/L，pH7.6）：取盐酸三乙醇胺18.6g，加水200ml溶解，加乙二胺四乙酸二钠3.7g，溶解后，用2mol/L氢氧化钠溶液(约18ml)调节pH值至7.6，加水稀释至250ml。或取三乙醇胺17.5g，加水约200ml，加盐酸4ml，混匀，加乙二胺四乙酸二钠3.7g，溶解后，用2mol/L氢氧化钠溶液或2mol/L盐酸溶液调节pH值至7.6，加水稀释至250ml。滤过后4℃保存,一周内使用。
还原型辅酶Ⅰ（NADH）溶液：取NADH二钠盐7mg，溶于2ml盐酸三乙醇胺缓冲液（pH7.6）中。4℃保存。
3-磷酸甘油脱氢酶-磷酸丙糖异构酶混悬液（GDH/TIM）：取3-磷酸甘油脱氢酶混悬液（GDH）与磷酸丙糖异构酶混悬液（TIM）适量，用3.2mol/L硫酸铵溶液（pH6）稀释成每1ml约含GDH310U和TIM1550U的溶液。4℃保存。
醛缩酶混悬液（ALD）：取醛缩酶混悬液（ALD）适量，用3.2mol/L硫酸铵溶液（pH6）稀释成每1ml中约含ALD90U的溶液。
（2）供试品溶液的制备 取本品适量，精密称定，加水溶解并制成每1ml约含0.2mg（以无水物计）的溶液。
（3）测定法 精密量取盐酸三乙醇胺缓冲液（pH7.6）3.0ml，供试品溶液0.1ml，还原型辅酶Ⅰ溶液0.05ml，甘油磷酸脱氢酶/磷酸丙糖异构酶混合混悬液0.02ml，置1cm吸收池中，摇匀，放置15分钟；另取盐酸三乙醇胺缓冲液（pH7.6）3.15ml，甘油磷酸脱氢酶/磷酸丙糖异构酶混合混悬液0.02ml，置另一吸收池中，摇匀，作为空白，照紫外-可见分光光度法（中国药典2005年版二部附录Ⅳ A），在340nm波长处测定供试品溶液的吸光度A1，再在每池中加醛缩酶混悬液0.02ml，摇匀，于20℃～25℃放置约5分钟，在340nm波长处测定供试品池的吸光度，直至吸光度基本不变读取吸光度A2。求出吸光度差值ΔA（ΔA=0.9937A1-A2），按下式计算，即得。
果糖二磷酸钠（%）=
式中 0.9937为3.17/3.19；
3.19为样品池中溶液的最终体积（ml）；
6.29 103为还原型辅酶Ⅰ(NADH)的摩尔吸收系数；
2为果糖二磷酸钠反应系数；
406.06为C6H11Na3O12P2的分子量；
0.1为供试品溶液加入体积(ml)；
W为供试品的取样量(mg)（以无水物计）。
